納米抗體(Nanobody，Nb)是僅存在于駱駝科動物(如駱駝、羊駝)和鯊魚中的天然缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(CH1)的特殊抗體，具有分子量小、穩(wěn)定性高、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)勢，在疾病診斷、治療和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。
 

　　在納米抗體制備過程中，需要注意以下關(guān)鍵事項(xiàng)：
 

　　1.抗原設(shè)計與制備
 

　　抗原純度：高純度的抗原能夠減少免疫動物對雜質(zhì)蛋白的免疫反應(yīng)，提高特異性納米抗體的產(chǎn)生幾率。例如，通過親和層析、離子交換層析等純化技術(shù)，將抗原的純度提高到95%以上。
 

　　抗原構(gòu)象：盡量保持抗原的天然構(gòu)象，通常識別抗原的天然表位。如果抗原在制備過程中發(fā)生變性或構(gòu)象改變，可能會導(dǎo)致免疫動物產(chǎn)生的抗體無法識別天然狀態(tài)下的抗原。例如，對于一些蛋白質(zhì)抗原，可以采用溫和的提取和純化方法，避免使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高溫等可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的條件。
 

　　2.cDNA合成與抗體基因擴(kuò)增
 

　　逆轉(zhuǎn)錄酶選擇：選擇保真性好的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成，以保證cDNA的完整性和準(zhǔn)確性。不同的逆轉(zhuǎn)錄酶可能對RNA的模板要求不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
 

　　引物設(shè)計：設(shè)計特異性引物用于擴(kuò)增納米抗體的可變區(qū)基因。引物的設(shè)計要考慮到抗體基因的保守序列，同時避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。可以通過生物信息學(xué)軟件對引物的特異性、Tm值等參數(shù)進(jìn)行分析和優(yōu)化。
 

　　PCR擴(kuò)增條件：優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，包括退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等，以提高抗體基因的擴(kuò)增效率和特異性。過高的退火溫度可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，而過低的退火溫度則可能增加非特異性擴(kuò)增。
 

　　3.篩選方法的選擇
 

　　固相篩選與液相篩選：根據(jù)抗原的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的篩選方法。固相篩選適用于純化的抗原固定在固相載體上，操作相對簡單；液相篩選則更接近天然狀態(tài)下的抗原-抗體相互作用，能夠篩選到親和力更高的納米抗體。例如，對于一些小分子抗原，液相篩選可能更為合適。
 

　　篩選輪次與嚴(yán)格度：通常進(jìn)行3-4輪篩選，每輪篩選逐漸增加篩選的嚴(yán)格度，如減少抗原的用量、增加洗滌次數(shù)或延長洗滌時間等，以富集高親和力的納米抗體。但篩選輪次不宜過多，否則可能會導(dǎo)致抗體多樣性的喪失。